Dr. Antonino Nicotra
Istituto Sperimentale per la Frutticoltura Rome - Italy
První příklady programů šlechtění citrusů nalézáme v Itálii na konci 19. století, kdy velmi silná infekce houbou Phytophtora spp. zničila všechny stromy pomerančovníků (Citrus sinensis L. Osbeck), citroníků (C. limon L Burm. f.) a mandarin (C. deliciosa Ten.), které byly v této době rozmnožovány semeny; na Floridě zase po rozsáhlém poškození citrusů mrazy. Problém s houbou rodu Phytophtora byl vyřešen zavedením bigarádie (C. aurantium L.) jako podnože, zatímco Swingle a Webber na Floridě se pokusili přenést chladuvzdorné vlastnosti rodu Poncirus na pomerančovník. Dnes již víme, že žádný z jejich semenáčů nepřinesl jedlé plody, ale přesto vytvořili velké množství hybridů, z nichž vynikly zejména citranže 'Troyer' a 'Carrizo', které se později staly jednou z nejpoužívanějších podnoží.
Obvyklé metody šlechtění citrusů, a tudíž také mandarin, představují výběr přírodních nebo uměle vyvolaných mutací, nucelární výběr a hybridizaci. Výběr přirozeně lepších mutantů hrál vždy významnou roli v rozvoji citrusového průmyslu na celém světě. Z mnoha příkladů stojí za zmínku kultivary satsumy 'Ueno’ a ‘Miyagawa’, kultivary mandariny ‘Tardivo di Ciaculli’ a ‘Avana seedless’ a kultivary klementin ‘Arrufatina’, ‘Clemenpons’, ‘Hernadina’, ‘Marisol’, ‘Nour’, ‘Nules’, ‘Oronules’, ‘Comune ISA’, ‘Fedele’, ‘Spinoso’, ‘Rubino’ a ‘Tardivo.
Ošetření mutagenními činiteli, např. chemickými přípravky nebo ionizujícím zářením, může vést ke vzniku umělých mutací. Například pupeny klementiny ‘Monreal’ vystavené působení gama záření vytvářejí několik typů mutací, mezi kterými jsou téměř bezsemenné variety 'Monreal verde' a 'Monreal rosso', které dokonce rostou i v oblastech, kde je jinak pěstování klementin 'Comune' obtížné.
Pokud ke zkřížení použijeme jako rodičovské rostliny polyembryonické genotypy, získáme několik nucelárních semenáčů podobných mateřské rostlině a velmi málo nebo žádné hybridy. Tato vlastnost, která je velmi častá u pěstovaných druhů citrusů, umožňuje získat bezvirózní semenáče podobné mateřské rostlině (dokonce i když je infikovaná) a také vybrat mutanty s lepšími vlastnostmi, které lze z nucell získat. Vylepšení citrusů nucelárním výběrem zabere mnoho času v důsledku velmi dlouhé juvenilní fáze, pozdnímu nástupu plodnosti a vysoké trnitosti. Čekání je často splaceno výběrem několika semenáčů s lepší plodností a kvalitou plodů než byly obě rodičovské rostliny. Kultivary satsumy ‘Mihu’ a ‘Okitsu’ jsou nucelární výběry ‘Miyagawa’. V Itálii Istituto Sperimentale per l'Agrumicoltura of Acireale (ISA) získal několik nucelárních semenáčů z různých druhů citrusů a klonů, a pokud jde o mandariny, většina rozšířených pocházela z kultivarů ‘Mandarino tardivo di Ciaculli’ (nuc.60-22A-2, nuc.60-22A-7, 19 CN. L, 18 CN. L, 3DN6 N L.) a ‘Mandarino Avana apireno’ (nuc. 62- Ap-9, nuc.-62-Ap-14).
Aby hybridizace vedla ke vzniku nových genotypů, je podmíněna heterozygoty, které povedou k silné variabilitě vlastností potomstva, nucelární embryonií a dlouhou neplodnou juvenilní fází, která zabrání provést výběr semenáčů před 5 – 7 lety věku. V každém případě nejlepší výsledky hybridizace u druhů rodu Citrus byly obdrženy umělým zkřížením různých druhů typu mandariny. Významné příklady výběru hybridů představují: V Itálii ‘Palazzelli’, ‘Primosole’, ‘Simeto’, ‘Desiderio’, ‘Bellezza’ a ‘Sirio’; ve Spojených Státech ‘Kara’, ‘Wilking’, ‘Kinnow’, ‘Sunburst’ a ‘Fortune’; v Izraeli ‘Yafit’, ‘Norit’ a ‘Edit’; v Japonsku ‘Nankou’, ‘Hakaya’, ‘Tsunokaori’, ‘Benimadoca’, ‘Ariake’, ‘Amakusa’, ‘Hareyaka’, ‘Mihocore’, ‘Yoku’ a ‘Shiranuhi’, což jsou téměř všechno hybridy mezi satsumou, klementinou nebo typy mandariny. Jiné významné hybridy byly získány zkřížením typů mandariny a grapefruitu, jako jsou tanžela, nebo typů mandariny a pomerančovníku, které jsou nazývány tangory. Tyto hybridy jsou ve velkém pěstovány a postačuje zmínit tanžela ‘Orlando’, ‘Minneola’, ‘Nova’, ‘Mapo’ a ‘Cami’; poslední dvě jsou rozšířeny i v Itálii. Pokud jde o tangory, rozšířen byl pouze japonský kultivar ‘Kiyomi’, získaný umělým zkřížením, zatímco většina mnohem významnějších je dnes považována za přirozené hybridy jako například ‘Ellendale’ v Austrálii, ‘Temple’ ve Spojených Státech, ‘Iyo’, ‘Miyauki Iyo’ a ‘Otani Iyo’ v Japonsku, ‘Murcott’ v Brazílii, ‘Ortanique’ v Maroku a mnohem později také v Itálii a jiných středomořských státech.
Umělá hybridizace k vytváření triploidních kříženců představuje slibnou metodu pro vytváření bezsemenných kultivarů citrusů a tudíž zlepšení programů pro vylepšení mandarin. Ve skutečnosti jsou samičí i samčí gamety triploidních genotypů sterilní v důsledku zkrouceného uspořádání chromozomů. Triploidní kříženci mohou vzniknout zkřížením mezi samičím tetraploidním a samčím diploidním rodičem. Avšak tento typ křížení přináší jen málo hybridů a vzniká mnoho nucelárních semenáčů díky vysoké úrovni polyembryonie tetraploidní samičí rodičovské rostliny. Je-li naopak použito monoembryonických zygotických diploidních genotypů jako samičí rostliny a tetraploidních genotypů jako samčí, je vytvořeno pouze několik málo nezralých semen. Zachráněná nezralá embrya pěstovaná in vitro, vytváří triploidní hybridy produkující bezsemenné plody. V Itálii ISA poměrně nedávno představila ‘Tacle’, zajímavý triploidní hybrid klementina x ‘Tarocco‘ a v Izraeli byl vybrán spontánní triploidní hybrid ‘Winola’ z populace diploidních hybridů mezi mandarinou ‘Wilking’ a tanželem ‘Minneola’.
Použití moderních biotechnologií založených na tkáňové kultuře jednotlivých buněk, protoplastů, pletiv a na rekombinantní DNA, umožňuje překonat některé omezující faktory konvenčního šlechtění. Ve skutečnosti to dává možnost vytváření nových genotypů přímým přenosem užitečných genů a prováděním výběru na buněčné a molekulární úrovni.
Většina druhů citrusů je schopná znovuvytvořit rostliny in vitro organogenezí z explantátů kotyledonů, epikotylů, pupenů, kořenů a granulí dužniny. Podnože citranže ‘Troyer’, ’Carrizo’ a ‘Flying Dragon’ jsou normálně již několik let rozmnožovány z úžlabních pupenů. V případě polyembryonických citrusů je možné regenerovat rostliny somatickou embryogenezí z nucelárního pletiva.
Prostřednictvím kultury in vitro mohou být získány z nevyvinutých vajíček extrahovaných ze zralých plodů (in vitro) embryogenní kalusy, embrya a rostlinky z polyembryonických druhů citrusů a kultivarů, které produkují bezsemenné plody. Tato vajíčka představují první fázi semen, která později nemohou pokračovat v růstu v důsledku nedostatečného oplodnění. V první fázi vývoje obsahují několik nucelárních zárodků, které, pokud jsou kultivovány v příslušném médiu in vitro, vedou ke vzniku cyklu regenerace vajíčko-kalus-zárodek-rostlina. Prostřednictvím této techniky, využívané zvláště v Itálii (ISA), Japonsku, USA, bylo získáno několik somatoklonálních kultivarů a selekcí různých druhů citrusů.
Mutace buněk rostoucích in vitro jsou definovány jako somatoklonální variace. Tento fenomén má značný význam, tak důležitý jako přirozené mutace, protože vede k malým pozitivním genetickým modifikacích v somatických klonech, například ztrátě trnů, menšímu vzrůstu, kratší juvenilní fázi, dřívějšímu nástupu plodnosti, lepšímu výnosu a velikosti plodů, časnějšímu dozrávání, aniž by docházelo k modifikaci nejvýznamnějších vlastností druhu nebo kultivaru.
Další významnou technikou je somatická hybridizace, která je charakterizována spojením dvou protoplastů, přičemž jeden pochází z embryogennního kalusu a druhý z listového mezofylu. Spojení je uskutečněno prostřednictvím polyetylenglykolu (PEG) nebo elektrofúze, která je založena na rozdílu potenciálu dvou elektrických polí. Tudíž somatické hybridy jsou allotetraploidní (2n + 2n = 36 chromozomů), protože obsahují dvě kompletní sady chromozomů ze dvou genotypů. Mnoho somatických hybridů bylo vytvořeno na Floridě, v Japonsku, Izraeli, Španělsku a Itálii. Tyto tetraploidní rostliny mají přímý potenciál kultivaru; ale jejich největší cena bude spočívat v tom, že jako rodičovské rostliny zkřížené s vybranými monoembryonickými diploidními jedinci povedou k bezsemenným triploidním rostlinám.
V Číně byl nedávno získán hexaploidní somatický hybrid elektrofúzí mezi diploidními jedinci pomerančovníku Citrus sinensis a jeho pohlavně inkompatibilního příbuzného Clausena lansium. Jde o první oznámení hexaploidního somatického hybridu získaného fúzí mezi dvěma diploidními jedinci čeledi Aurantioideae.
Somatická hybridizace je velmi důležitá při vytváření nových podnoží. Na Floridě byly získány somatické hybridy mezi podnožemi patřícími do rodu Citrus nebo i cizími, aby se do jednotlivých rostlin vnesly vlastnosti rezistence vůči tristéze, Phytophtora ssp., nematodám nebo vápenatým půdám, které jsou separátně přítomné v jedné ze dvou podnoží.
Hlavními úkoly šlechtitelských programů mandarin, kterými se zabývají nejvýznamnější výzkumné světové instituce jsou: rozšíření období dozrávání (ranější nebo pozdnější kultivary), bezsemennost, snadná loupatelnost, vynikající zbarvení oplodí, malý sklon ke střídavé plodnosti, dobrá chuť, lepší standardizace plodů (tvaru a velikosti), chemické složení plodů a jejich chování po sklizni, odolnost vůči nejnebezpečnějším škůdcům a chorobám.
Protože většinu výše uvedených rysů můžeme nalézt u přirozených mutací, zvláště těch týkajících se plodů, řada aktuálních kultivarů byla vybrána soukromými farmáři a školkaři, ačkoli oficiálně byly často zaváděny a uvolňovány výzkumnými institucemi. Některé druhy mutací lze získat použitím mutagenních přípravků, ale častěji a v mnohem omezenějším prostoru, než se tomu děje v přírodě.
Program pro vývoj bezsemenných mutací existujících kultivarů probíhá na University of California - Riverside (UCR) ozařováním pupenů semenných, ale slibných kultivarů. UCR identifikovala šest slibných mutantních selekcí s nízkým počtem semen, kterou jsou nyní zkoušené ve smíšené výsadbě. Jiný program je prováděn v Číně ve stanici Cash Crop Station, Xiangxi, kde byla získána selekce ‘Fuyu 28’ u ozářených (gama paprsky) pupenů kultivaru ‘Ponggan’; v Guandong Fruit Research Institute, který identifikoval některé slibné bezsemenné selekce a v Changqing Fruit Farm, Guandong, který nedávno uvolnil variety ‘Huaqing Seedless’ a ‘Huaqing Few Seeded’.
Jiný přístup k vývoji bezsemenných kultivarů zahrnuje hybridizaci mezi diploidním a tetraploidním jedincem k vytvoření triploidního potomka, který je vždy obzvlášť bezsemenný nebo produkuje samčí sterilní hybridní semenáče. Konvenční cytologická metoda pro identifikaci triploidního exempláře je laboratorní technika zahrnující přípravu kořenových špiček pro analýzu chromozomů. Užitečná technika (digitální denzitometrie isozymů) pro rychlé a levné odlišení triploidního citrusu ve větší populaci semenáčů byla vyvinuta v Central Queensland University v Austrálii. Zajímavé studie byly provedeny v Japonsku ohledně dědičnosti počtu semen a výnosu pylu u hybridních potomků pocházejících ze zkřížení kultivarů odlišných druhů citrusů, které nalezly pozitivní korelaci mezi průměrným počtem semen v plodu u dvou rodičů a u jejich potomků. UCR v USA a ISA v Itálii vedou ve šlechtitelských programech vytváření triploidních hybridů a nedávno uvolnily kultivary ‘Gold Nugget’ a ‘Tacle’, respektive ‘Clara’. UCR identifikovala seed-specific geny u mandarin (chimerický gen), který je-li vpraven do genomu mandariny, mohl by regenerovat transgenní rostliny mandarin.
Dědičnost vlastností oplodí citrusových plodů byla studována na velkém množství semenáčů pocházejích ze několika zkřížení mezi různými druhy a typy citrusů ve šlechtitelské stanici Fruit Tree Research Station, Kuchinotusu Nagasaki, v Japonsku. Variety mandarin, tanžerin, tangorů, Naruto, Hyuganatsu a většina tanžel má sklon vytvářet „volné oplodí“ nebo snadno loupatelné potomstvo. Grapefruit, ‘Hassaku’, ‘Kawachi-bankan’, ‘Tosa-buntan’ a ‘Natsumikan’ produkují polovinu potomstva s „přiléhajícím oplodím“ a polovinu s „volným oplodím“. Zkřížení mezi pomerančovníkem a mandarinou přineslo vysokou četnost potomků s „volným oplodím“.
Důležitým cílem šlechtitelů je chladuvzdornost citrusů. Nedávné studie provedené na Univerzitě Huazhong Ministerstva zemědělství v Hubei (Čína) ukázaly, že chladuvzdornost je řízena polygenně multigenes. U mandarin jako skupiny a zvláště pak u kultivarů ‘Changsha’ a ‘Owari’ byla zjištěna tolerance vůči chladu a náchylnost produkovat tolerantní potomstvo. Také klementiny ‘Robinson’, ‘Page’, ‘Nova’ a nově uvolněná ‘Ambersweet’ jsou považovány za tolerantní vůči chladu.
V Čínské provincii Jiangxi je popsán kultivar mandariny ‘Jiouyuezao‘ (C. reticulata) jako velmi otužilý, strom přežívající tak nízké teploty jako –13,4°C, zatímco mandariny
‘Tuanianiju’, ‘Bendizao’ a satsuma ‘Xingjin’ v provincii Hunan jsou považovány otužilé, protože snesou bez poškození mrazy –12,1°C.
V Japonsku kultivary tangoru ‘Seihou’ a ‘Tsunokaori’ a mandarina ‘Hayaka’ vykazovaly odolnost vůči strupovitosti (Elsinoe fawcetti) ve výzkumné stanici Fruit Tree Research Station v Nagasaki, stejně jako kultivar ‘Kousyun Ponkan’ ve stanici Fruit Tree Research Station, Shimizu, Shizuoka, zatímco nově uvolněná mandarina ‘Egan’ v Číně (provincie Hubei) je také považována za vysoce rezistentní. Na Floridě USDA-ARS ukázala, že kultibvar ‘Fallglo’ je rezistentní vůči jinému agens vyvolávajícímu strupovitost (Sphaceloma fawcetti).
V Japonsku tangor ‘Kiyomi’ byl označen za rezistentní vůči rakovině stromů (Xanthomonas axonopodis pv citri) ústavem National Institute of Fruit Tree Science, Nagasaki, zatímco ‘Nankou’ a ‘Kousyun Ponkan’ jsou považovány za rezistentní vůči dalšímu agens vyvolávajícímu rakovinu stromů (Xanthomonas campestris) ústavem National Institute of Fruit Tree Science a stanicí the Fruit Tree Research Station, Shizuoka.
V Brazílii v plošné studii rozsáhlé zárodečné citrusové plazmy na toleranci k Xylella fastidiosa, vyvolavateli citrusové chlorózy (citrus variegated chlorosis = CVC), uspěly jako rezistentní tangor ‘Murcott’ a mandariny ‘Mexerica do Rio’, ‘Ponkan’ a ‘Cravo’.
Na odolnost vůči hmyzu existuje jen několik málo šlechtitelských programů. Institute of Botany, Academia Sinicia, Taipei (Taiwan), nedávno získal tři domněle transgenní rostliny z excidovaných nucelli mandariny ‘Blanco’ cv. ’Ponkan ’ pěstovanými v kultuře společně s Agrobacterium tumefaciens nesoucími plazmid s Coleoptera-specifickým insekticidním genem z B. thuringiensis ssp. Tenebrionis. Tři rostliny exprimující gen jsou aktuálně pěstovány pro další testy odolnosti vůči hmyzu. V polní studii provedené v indickém Pundžábu zahrnující početné druhy a kultivary citrusů – citranže ’Carrizo ’, ’Sacatan ’, ’Savage ’, Troyer’, ’Yama ’, citrumelo (P. trifoliata x grapefruit), ’Campbell Valencia’, ’Pomary ’ a ’Robidoux ’ - byly shledány jako rezistentní Phyllocnistis citrella a tudíž jsou považovány za zajímavý zdroj zárodečné plazmy pro rezistenci vůči hmyzu.
Běžným cílem šlechtitelských programů je vytvořit citrusovou podnož odolnou vůči škůdcům a chorobám, zvýšit přizpůsobivost k různým půdám a podmínkám prostředí, předat roubům vysokou plodnost, plody vysoké kvality a velikosti s další zásadní vlastnosti.
Potenciál konvenčních metod vylepšení citrusových podnoží je limitován biologickými faktory, které brání šlechtění a výběru, jako jsou například heterozygotní a inbreeding depression, sterilita pylu a vajíček, pohlavní inkompatibilita, apomixes a nucelární polyembryonie, juvenilita. Avšak USDA, ARS, US Horticultural Research Laboratory vytvořila v průběhu programu vývoje nových podnoží, který byl zaměřen na pohlavní hybridizaci na diploidní úrovni ke zlepšení genetických kombinací. To nedávno uvolnilo dva hybridy ‘US-852’ [mandarina ’Changsha ’ (C. reticulata) x Poncirus trifoliata ’English Large Flowered’] a ‘US-812’ (mandarina ’Sunki ’ x Poncirus trifoliata ’Benecke ’), které vytváří zdravé stromy, s plody vynikající kvality a vyznačují se značnou plodností.
Ve Španělsku IVIA uvolnila dvě podnože v roce 1998 a dvě v roce 2000 získané pohlavní hybridizací. Jednalo se o ‘Forner Alcaide 5’ (F&A 5), ‘Forner Alcaide 418’ (F&A 418), Forner Alcide 13’ (F&A 13) a ‘Forner Alcaide 517’ (F&A 517), které jsou rezistentní nebo tolerantní vůči CTV a zasolené půdě. Navíc je ‘F&A 5’ (mandarina ’Cleopatra ’ x P. trifoliata) rezistantní vůči citrusovým nematodám a má dobrou toleranci na vápenaté půdy a přemokření. ‘F&A 13’ (mandarina ’Cleopatra ’ x P. trifoliata) je citlivá vůči napadení citrusovými nematody, ale vysoce tolerantní na zasolené půdy a přemokření. ‘F&A 418’ (citranž ‘Troyer‘ x běžná mandarina) je zakrslá podnož s dobrou tolerancí vápenitých půd, citlivá vůči napadení citrusovými nematody a indukuje tvorbu velkých plodů na naroubované variety. ‘F&A 517’ (mandarina ‘King‘ x P. trifoliata) je také zakrslá podnož a vyznačuje se dobrou tolerancí vápenatých a zasolených půd.
Somatická hybridizace technikou fúze protoplastů je nová cesta ke vzniku nových vylepšených citrusových podnoží, která může překonat bariéry dané rozmnožovacími zvláštnostmi citrusů. Většina vědeckých institucí zabývajících se šlechtěním s úmyslem vylepšit podnože, využívá této technologie. Je velmi dobře rozvinutá zařízeními: University of Florida, IFAS, CREC, CIRAD ve Francii, I.V.I.A. ve Španělsku, ISA a Centro di Studio per il Miglioramento Genetico degli Agrumi, CNR, v Itálii.
Šedesát somatických hybridů (SH) bylo vytvořeno protoplastickou fúzí v CREC na Floridě. SH obsahující zárodečnou plazmu kultivaru ‘Flying Dragon‘ bylo extrémně zakrslých a předčasně zralých, ty z nich obsahující geny pomerančovníku byly důsledně rezistentní vůči houbě Phytophtora, zatímco hybridy rodů Fortunella, Citropsis, Atalantia, Microcitrus a Citrus ichangensis byly rezistentní vůči nematodám Radopholus citrophilus. Navíc semena z SH dobře vyklíčila a vytvořila robustní semenáče.
CIRAD ve Francii vybral odolný a tristéza-rezistentní mezidruhový somatický hybrid mezi Poncirus trifoliata a Citrus deliciosa, který je odolný vůči vru tristézy (citrus tristeza closterovirus).
Biotechnologie využívané při šlechtění citrusů otevírají nové entuziastické vyhlídky pro zlepšení citrusového průmyslu, dokonce i když nemohou přinést okamžité výsledky. Tudíž v současnosti a blízké budoucnosti, zůstávají konvenční šlechtitelské metody základem šlechtitelských programů citrusů.
Biotechnologie mohou aktuálně přinést významné výsledky při šlechtění přenosem genů , které řídí rezistenci vůči chorobám, hmyzu a herbicidům, ale jejich využití při zlepšování kvantitativních vlastností, jako jsou výnosnost a kvalita plodů, se nezdají být okamžité.
Vyvážené splynutí těchto dvou metod šlechtění, konvenční a biotechnologií, představuje patrně nejlepší cestu, kterou se bude vývoj v citrusovém průmyslu ubírat.